Introducción
⌅La
pérdida creciente de especies vegetales, debido a la deforestación, el
cambio climático, la salinización de los suelos y la sustitución de las
variedades tradicionales por cultivares mejorados en grandes extensiones
agrícolas, ha generado, entre otras causas, el interés de los
investigadores por conservar el germoplasma vegetal. El 90 % de las
plantas angiospermas pueden conservarse en bancos de semillas, pero a
partir de modelos predictivos y análisis de datos, se estima que la
mitad de las especies vegetales no pueden ser almacenadas en estos
bancos. Entre ellas se encuentran las especies de reproducción
vegetativa y las que poseen semillas excepcionales o intermedias;
además, de otras que no producen semillas como los helechos y los
musgos. Se ha calculado que entre las especies que no pueden ser
preservadas en los bancos convencionales existentes, alrededor de 60 000
son de interés para la conservación (Walters y Pence, 2020Walters
C. y Pence, V.C. (2020). The unique role of seed banking and
cryobiotechnologies in plant conservation. Plants People Planet. 2020:
00:1-9. https://doi.org/10.1002/ppp3.10121
).
Para
las especies que no pueden ser conservadas mediante las semillas, la
criopreservación es la única técnica disponible en la actualidad para
garantizar la conservación de su germoplasma de forma segura y
económicamente eficiente (Engelmann, 2012Engelmann, F. (2012). Germplasm collection, storage, and conservation. Elsevier Inc. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-341466-1.00017-1
).
Producto de más de 60 años de investigaciones, se han desarrollado
protocolos que permiten obtener altos porcentajes de recuperación de
plantas post-criopreservación, y se considera que alrededor de 10 000
accesiones se conservan, actualmente, de forma segura mediante esta
criobiotecnología (Panis, 2019Panis,
B. (2019). Sixty years of plant cryopreservation: from freezing hardy
mulberry twigs to establishing reference crop collections for future
generations. Proc. III International Symposium of Plant
Cryopreservation. Acta Hortic. 1234. ISHS. https://doi.org/10.17660/ActaHortic.2019.1234.1
).
En este trabajo se explican los principios básicos de la criopreservación y se resumen las características fundamentales de los protocolos más estudiados hasta el presente, con especial atención a su aplicación para la conservación del germoplasma de ajo, una especie de reproducción vegetativa y de importancia agrícola y medicinal, lo cual le confiere especial interés a su preservación.
Desarrollo
⌅Principios de la criopreservación
⌅La criopreservación es el proceso mediante el cual las células o los tejidos biológicos se preservan por enfriamiento a temperaturas ultra-bajas, como la del nitrógeno líquido (-196 °C). A estas temperaturas, cualquier actividad biológica (incluyendo las reacciones bioquímicas que conducen al envejecimiento y la muerte celular) es ralentizada, de manera que el material biológico mantenido en esas condiciones puede ser almacenado por períodos muy prolongados.
La
criopreservación se basa en la extracción del agua congelable de los
tejidos por deshidratación física u osmótica, seguido por el
enfriamiento ultra-rápido por inmersión en el nitrógeno líquido; y
actualmente, se considera que es la perspectiva biotecnológica más
novedosa y asequible que permite la conservación segura, por largo
tiempo, de la biodiversidad vegetal, sin riesgos de modificaciones
genéticas (Benelli, 2021Benelli, C. (2021). Plant cryopreservation: a look at the present and the future. Plants 2021, 10, 2744. https://doi.org/10.3390/plants10122744
).
Este método de conservación es crucial para las plantas que no producen
semillas o que producen semillas que no germinan y se propagan
vegetativamente (Jiroutová y Sedlák, 2020Jiroutová, P. y Sedlák, J. (2020). Cryobiotechnology of Plants: A Hot Topic Not Only for Gene Banks. Appl. Sci. 2020, 10, 4677; https://doi.org/10.3390/app10134677
)
Como
se mencionó anteriormente, la criopreservación tiene como primer paso
la eliminación del agua congelable de los tejidos, mediante la
deshidratación. A un contenido de agua menor de 0,25 gH2O.gms-1 (ms, materia seca) se le denomina frecuentemente “agua no congelable” y las células vegetales que contienen de 0,25-0,4 gH2O.gms-1, usualmente, sobreviven a la exposición al nitrógeno líquido (Volk y Walters, 2006Volk,
G.M. y Walters, C. (2006). Plant vitrification solution 2 lowers water
content and alters freezing behavior in shoot tips during
cryoprotection. Cryobiology 2006, 52, 48–61.
; Jiroutová y Sedlák, 2020Jiroutová, P. y Sedlák, J. (2020). Cryobiotechnology of Plants: A Hot Topic Not Only for Gene Banks. Appl. Sci. 2020, 10, 4677; https://doi.org/10.3390/app10134677
).
La
única forma de evitar la formación de cristales de hielo a temperaturas
ultra-bajas sin una reducción extrema del contenido de agua es a través
de la fase física denominada “vitrificación”, que es la solidificación
de un líquido formando una estructura amorfa o vítrea (Panis, 2019Panis,
B. (2019). Sixty years of plant cryopreservation: from freezing hardy
mulberry twigs to establishing reference crop collections for future
generations. Proc. III International Symposium of Plant
Cryopreservation. Acta Hortic. 1234. ISHS. https://doi.org/10.17660/ActaHortic.2019.1234.1
; Panis et al., 2020Panis,
B.; Nagel, M. y Van den houwe, I. (2020). Challenges and prospects for
the conservation of crop genetic resources in field genebanks, in in
vitro collections and/or in liquid nitrogen. Plants 2020, 9, 1634; https://doi.org/10.3390/plants9121634
),
lo que significa que cuando se alcanza el estado sólido las moléculas
se asocian sin adquirir la estructura ordenada que corresponde a la
cristalización.
Todos los procedimientos desarrollados para la
criopreservación de los materiales biológicos están basados en la
optimización de la vitrificación, la que necesita dos condiciones para
que se produzca: 1) velocidades de enfriamiento ultra-rápidas, para
evitar que transcurra el tiempo necesario para que un cristal de hielo
pueda formarse antes que todas las moléculas queden inmovilizadas por la
temperatura ultra-baja, y 2) concentrar la solución celular, para que
relativamente más moléculas (de soluto) interfieran la organización de
las moléculas de agua para formar los cristales de hielo (Panis et al. 2020Panis,
B.; Nagel, M. y Van den houwe, I. (2020). Challenges and prospects for
the conservation of crop genetic resources in field genebanks, in in
vitro collections and/or in liquid nitrogen. Plants 2020, 9, 1634; https://doi.org/10.3390/plants9121634
).
Por ello, la vitrificación requiere de una solución altamente
concentrada, que deshidrate suficientemente los tejidos sin causar
daños, y haga posible que estos formen un estado vítreo estable (con la
solución altamente concentrada circundante) cuando sea sumergido en el
nitrógeno líquido (Matsumoto, 2017Matsumoto,
T. (2017). Cryopreservation of plant genetic resources: Conventional
and new methods. Reviews in Agricultural Science, 5: 13–20. https://doi.org/10.7831/ras5.13
).
La combinación de la deshidratación con el enfriamiento rápido de las
células causa que el agua residual solidifique sin cristalización, la
cual podría dañar a las células vivas (Taylor et al., 2004Taylor,
M.J.; Song, Y.C.; Brockbank, K.G.M. (2004). Vitrification in tissue
preservation: new developments. in life in the frozen state; Fuller,
B.J., Lane, N., Benson, E.E., Eds.; CRC Press: London, UK, pp. 603–644.
ISBN 978-0-203-64707-3.
).
Los agentes crioprotectores
⌅Los crioprotectores son sustancias que protegen las membranas y pueden formar un estado vítreo en las células. Se dividen en penetrantes y no penetrantes. Los que penetran al interior de las células tienen la función de reducir la deshidratación celular y el crecimiento de los cristales de hielo. Ellos son los principales constituyentes de las soluciones de vitrificación. Entre los más utilizados están el glicerol, el etilenglicol y el dimetilsulfóxido (DMSO), componentes de la solución de vitrificación PVS2.
Se considera que la actividad
crioprotectora del glicerol se debe a que forma enlaces de hidrógeno con
el agua, lo cual dificulta la formación de los cristales de hielo. Es
el menos tóxico en altas concentraciones comparado con otros
crioprotectores. El etilenglicol también actúa alterando los puentes de
hidrógeno y se ha encontrado que cuando se une con el agua, la mezcla de
40 % de agua y 60 % de etilenglicol disminuye el punto de de
congelación y va a ser incapaz de formar sustancias cristalinas, pero se
ha observado alguna toxicidad vinculada a este crioprotector (Bhattacharya, 2018Bhattacharya, S. (2018). Cryoprotectants and their usage in cryopreservation process. IntechOpen. https://dx.doi.org/10.5772/intechopen.80477
).
En cuanto al DMSO, Faltus et al. (2021)Faltus,
M.; Bilavcik, A. y Zamecnik, J. (2021). Vitrification ability of
combined and single cryoprotective agents. Plants 2021, 10, 2392. https://doi.org/10.3390/plants10112392
en su estudio, sobre la habilidad de diferentes agentes crioprotectores
para producir la vitrificación, concluyeron que el DMSO es el agente
crioprotector más efectivo. Al respecto, Samuels et al. (2021)Samuels,
F.M.D.; Stich, D.G.; Bonnart, R.; Volk, G.M. y Levinger, N.E. (2021).
Non-uniform distribution of cryoprotecting agents in rice culture cells
measured by CARS microscopy. Plants 10, 589. https://doi.org/10.3390/plants10030589
señalaron que se conoce que el DMSO rompe la red de enlaces de
hidrógeno del agua y favorece la vitrificación sobre la cristalización.
Esta característica puede ser el factor significativo que sustenta la
inclusión del DMSO en la combinación de agentes crioprotectores y la
frecuencia del uso de las soluciones basadas en el DMSO (Faltus et al.,2021Faltus,
M.; Bilavcik, A. y Zamecnik, J. (2021). Vitrification ability of
combined and single cryoprotective agents. Plants 2021, 10, 2392. https://doi.org/10.3390/plants10112392
).
Mediante
la espectroscopia CARS (espectroscopía coherente anti Stokes Raman) y
el uso de d6-DMSO (DMSO marcado con deuterio, un isotopo no radiactivo
del hidrógeno), se pudo comprobar que el DMSO no se distribuye
uniformemente en el interior de las células, sino que se acumula dentro
de los organelos (Samuels et al. 2021)Samuels,
F.M.D.; Stich, D.G.; Bonnart, R.; Volk, G.M. y Levinger, N.E. (2021).
Non-uniform distribution of cryoprotecting agents in rice culture cells
measured by CARS microscopy. Plants 10, 589. https://doi.org/10.3390/plants10030589
.
Sobre la base de sus experimentos, los autores estiman que los
organelos que captan el DMSO son los amiloplastos y los cuerpos de
almidón. Un incremento en la concentración del DMSO en esos organelos
pudiera favorecer su protección y al mismo tiempo, son los que están en
mayor riesgo de daño debido a la toxicidad del DMSO, el cual en altas
concentraciones puede producir la ruptura de las membranas.
En
cuanto a la función de los crioprotectores no penetrantes, se consideran
que pueden incrementar la tonicidad de las soluciones de vitrificación,
lo cual contribuye a evitar el daño por congelación. La sacarosa, que
es un carbohidrato natural en las células, a baja temperatura (−45 °C)
proporciona la nutrición requerida para la preservación de las células y
combinada con el DMSO mantiene buenas propiedades de crioprotección (Bhattacharya, 2018Bhattacharya, S. (2018). Cryoprotectants and their usage in cryopreservation process. IntechOpen. https://dx.doi.org/10.5772/intechopen.80477
).
Generalmente,
se recomienda una combinación de agentes crioprotectores para evitar el
riesgo del daño de las muestras por la citoxicidad. La combinación de
los agentes crioprotectores puede disminuir la porción de los
componentes individuales por debajo de su umbral de toxicidad (Faltus et al., 2021Faltus,
M.; Bilavcik, A. y Zamecnik, J. (2021). Vitrification ability of
combined and single cryoprotective agents. Plants 2021, 10, 2392. https://doi.org/10.3390/plants10112392
).
Sobre
la base del efecto preservador de los crioprotectores y, al mismo
tiempo, su posible toxicidad en altas concentraciones, se han diseñado
diferentes soluciones combinando los crioprotectores penetrantes y no
penetrantes. De ellas, las más utilizadas son la solución PVS2 (plant
vitrification solution) y la PVS3. La PVS2 está constituida por 30 %
glicerol + 15 % etilenglicol + 15 % DMSO + 0,4 M sacarosa (Sakai et al., 1990Sakai,
A.; Kobayashi, S. y Oiyama, I. (1990). Cryopreservation of nucellar
cells of navel orange (Citrus sinensis Osb. var. brasiliensis Tanaka) by
vitrification. Plant Cell Rep. 9: 30-33. https://doi.org/10.1007/BF00232130
); y la PVS3, por 40 % glicerol y 40 % de sacarosa (Nishizawa et al., 1993Nishizawa, S.; Sakai, A.; Amano, Y. y Matsuzawa, T. (1993). Cryopreservation of asparagus (Asparagus officinalis) embriogenic suspension cells and subsequent plant regeneration by vitrification. Plant Sci. 91.1: 67-73. https://doi.org/10.1016/0168-9452(93)90189-7
); aunque también aparece en la literatura con la proporción 50 % de glicerol y 50 % de sacarosa (Keller y Senula, 2013Keller, E.R.J. y Senula, A. (2013). Micropropagation and cryopreservation of garlic (Allium sativum L.). En: M. Lambardi et al. (eds.), Protocols for Micropropagation of Selected Economically-Important Horticultural Plants, Methods in Molecular Biology, vol. 994. https://doi.org/10.1007/978-1-62703-074-8_28.
; Panis, 2019Panis,
B. (2019). Sixty years of plant cryopreservation: from freezing hardy
mulberry twigs to establishing reference crop collections for future
generations. Proc. III International Symposium of Plant
Cryopreservation. Acta Hortic. 1234. ISHS. https://doi.org/10.17660/ActaHortic.2019.1234.1
).
Aplicación de la criopreservación a diferentes tipos de material vegetal
⌅Se han aplicado distintas técnicas criogénicas a un amplio rango de explantes, incluyendo el polen, las semillas, los embriones cigóticos y somáticos, las suspensiones celulares o los cultivos de callos, las yemas apicales, los ápices y las yemas dormantes. La selección del explante también está relacionada con el mejor método de recuperación in vitro (post-criopreservación) del material biológico, para un genotipo en específico (Benelli, 2021.)
Protocolos para la criopreservación vegetal
⌅Técnicas clásicas. Enfriamiento lento (slow freezing)
⌅ Quatrano (1968)Quatrano, R.S. (1960). Freeze preservation of cultured flax cell utilizing dimetilsulfoxide. Plant Phisiol. 43 (12): 2057-2061. https://doi.org/10.1104/pp.43.122057
describió el primer reporte sobre la aplicación del protocolo de
enfriamiento lento a los tejidos vegetales. Con la reducción de la
temperatura mediante el enfriamiento lento, se inicia la formación de
cristales de hielo (seeding) en el medio exterior a la célula, la
membrana actúa como una barrera física y previene la formación de hielo
dentro de la célula; por lo éstas se mantienen sin la formación de hielo
(sobreenfriadas). A medida que la temperatura disminuye, una cantidad
creciente de la solución extracelular se convierte en hielo, lo que
resulta en la concentración de los solutos intracelulares. En
dependencia de la velocidad del enfriamiento y de la temperatura de
pre-congelación, van a salir diferentes cantidades de agua de las
células antes de que solidifiquen.
El protocolo del enfriamiento
lento incluye los siguientes pasos: 1) precultivo de las muestras, 2) la
crioprotección, 3) el enfriamiento lento (0,5-2,0 oC.min-1 hasta una temperatura determinada; usualmente -40 oC),
4) la inmersión rápida de las muestras en nitrógeno líquido, 5) el
almacenamiento, 6) transferencia rápida de las muestras a la temperatura
ambiente (recalentamiento) y 7) la recuperación. Aunque su desventaja
consiste en que requiere del uso de equipos específicos para producir el
enfriamiento lento, ha sido aplicado exitosamente para la
criopreservación de cultivos indiferenciados, como las suspensiones
celulares (Engelmann, 2012Engelmann, F. (2012). Germplasm collection, storage, and conservation. Elsevier Inc. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-341466-1.00017-1
)
Por su parte, Matsumoto (2017)Matsumoto,
T. (2017). Cryopreservation of plant genetic resources: Conventional
and new methods. Reviews in Agricultural Science, 5: 13–20. https://doi.org/10.7831/ras5.13
señaló como técnicas clásicas para la criopreservación el enfriamiento
lento y el enfriamiento simple. Describe el método enfriamiento lento
(slow freezing), en concordancia con lo referido por Engelmann (2012)Engelmann, F. (2012). Germplasm collection, storage, and conservation. Elsevier Inc. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-341466-1.00017-1
,
con los pasos siguientes: 1) las muestras (ápices, embriones y células)
se empacan en criotubos; 2) se tratan con agentes crioprotectores
(DMSO, glicerol, etilenglicol y sacarosa); 3) se induce la iniciación
del hielo (extracelular, seeding) a -7 oC; 4) se enfrían a 0,3-0,5 oC min-1 hasta -40 oC
usando un congelador programable (para la deshidratación) y 5) se
sumergen en el nitrógeno líquido. Respecto al método enfriamiento simple
(simple freezing) indica que las muestras se empacan en los criotubos,
se tratan con un crioprotector a 25 oC, se enfrían a -30 oC para la deshidratación y se sumergen en el nitrógeno líquido.
Protocolos de enfriamiento rápido
⌅Gota (“Droplet freezing”)
⌅ Este protocolo fue desarrollado por Schäfer-Menuhr et al. (1996)Schäfer-Menuhr,
A., Müller, E. y Mix-Wagner, G. 1996. Cryopreservation: an alternative
for the long-term storage of old potato cultivars. Potato Res. 39 (4),
507–513 https://doi.org/10.1007/BF02358469.
para criopreservar una colección de variedades de papa (Solanum tuberosum L.). Los ápices de las vitroplantas de 2-3 mm de largo y 0,5-1 mm de
ancho se mantuvieron en medio de cultivo durante la noche. Al día
siguiente, se colocaron durante dos horas en una solución crioprotectora
(10 % DMSO en medio de cultivo) a la temperatura ambiente. A
continuación, se pipetearon gotas de 2.5 μL de la solución
crioprotectora sobre láminas de aluminio estéril de 0,7 por 2 mm y 0,03
mm de grueso, a razón de seis gotas por lámina. Se transfirió un ápice a
cada gota y el enfriamiento se realizó por inmersión directa en el
nitrógeno líquido. Para la conservación, se colocaron dos láminas por
cada criovial de 2 mL, los que se habían enfriado previamente en el
nitrógeno líquido. La utilización del soporte de aluminio y la
introducción de la muestra en el nitrógeno líquido sin otra superficie
intermedia que la gota, permite obtener un enfriamiento ultra-rápido, en
favor de evitar la cristalización del agua celular durante los procesos
de enfriamiento y el retorno a la temperatura ambiente.
Según Faltus et al. (2021)Faltus,
M.; Bilavcik, A. y Zamecnik, J. (2021). Vitrification ability of
combined and single cryoprotective agents. Plants 2021, 10, 2392. https://doi.org/10.3390/plants10112392
,
este método no está basado en la vitrificación de la muestra, ya que la
baja concentración del DMSO utilizada no es suficiente para impedir la
congelación del agua, de ahí su nombre droplet-freezing. Sus resultados
positivos se asocian a que el DMSO induce algunos cambios
ultraestructurales en las células tratadas que ayudan a superar la
congelación del agua sin daños que conduzcan a la muerte celular.
Protocolo encapsulación-deshidratación
⌅Fue desarrollado por Fabre y Dereuddre, en 1990Fabre, K. y Dereuddre, J. (1990). Encapsulation dehydration – a new approach to cryopreservation of solanum shoot tips. Cryo Lett. 11: 417-416.
, para la criopreservación de ápices del género Solanum. El protocolo consta de los pasos siguientes: 1) los ápices, se
suspenden en un medio libre de calcio suplementado con alginato de sodio
al 3 %; 2) se dejan gotear sobre un medio con 100 mM de cloruro de
calcio, para formar capsulas de alginato de calcio; 3) las cápsulas, de
aproximadamente 3 mm de diámetro, conteniendo de uno a dos ápices, se
ponen a cultivar en medios líquidos enriquecidos en sacarosa; 4) las
capsulas, con alta concentración de sacarosa, se deshidratan en la
corriente de aire de un flujo laminar, a un contenido de humedad del
20-30 % y 5) las capsulas deshidratadas se trasladan a crioviales y se
sumergen en el nitrógeno líquido. La deshidratación también se puede
lograr poniendo las cápsulas en placas de Petri colocadas en recipientes
con sílica gel activada.
El tratamiento con sacarosa combinado
con la deshidratación resulta en la vitrificación de la matriz de
alginato y el explante embebido. La principal limitación de este método
es que algunas especies resultan muy susceptibles a las altas
concentraciones de sacarosa seguidas de la deshidratación y a que
requiere de varios días para la ejecución del protocolo (Panis, 2019Panis,
B. (2019). Sixty years of plant cryopreservation: from freezing hardy
mulberry twigs to establishing reference crop collections for future
generations. Proc. III International Symposium of Plant
Cryopreservation. Acta Hortic. 1234. ISHS. https://doi.org/10.17660/ActaHortic.2019.1234.1
).
Protocolos basados en la vitrificación
⌅Estos
protocolos se basan en producir la deshidratación celular antes del
enfriamiento, exponiendo las muestras a medios crioprotectores
concentrados y/o a la desecación por aire, seguido del enfriamiento, con
lo cual se evitan los factores que favorecen la formación de hielo
intracelular (Engelmann, 2012Engelmann, F. (2012). Germplasm collection, storage, and conservation. Elsevier Inc. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-341466-1.00017-1
).
Los
protocolos basados en la vitrificación tienen como ventaja, respecto a
los protocolos clásicos, que en ellos el paso crítico para la
supervivencia es la deshidratación y no el enfriamiento; de modo que si
las muestras pueden ser deshidratadas a un contenido de humedad
suficientemente bajo, sin que la supervivencia disminuya o disminuya
poco respecto al control no deshidratado; generalmente, no se observa la
caída de la supervivencia después de la criopreservación, o ésta es
limitada (Engelmann, 2012Engelmann, F. (2012). Germplasm collection, storage, and conservation. Elsevier Inc. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-341466-1.00017-1
).
El autor también señaló que estos protocolos son más apropiados para
los órganos complejos como los ápices de crecimiento y los embriones.
Protocolo vitrificación
⌅Estas
técnicas se basan en exponer las muestras a las soluciones
crioprotectoras altamente concentradas (para producir la deshidratación
de la muestra), seguido de un enfriamiento rápido. El protocolo de la
vitrificación típicamente incluye los pasos siguientes: 1) exponer la
muestra a una solución concentrada compuesta por glicerol y sacarosa
(solución de carga) que tiene como finalidad el aumento gradual de la
concentración de solutos; 2) la deshidratación con la solución de
vitrificación (más comúnmente la PVS2 y la PVS3); 3) el enfriamiento
rápido, mediante la inmersión directa de los crioviales en el nitrógeno
líquido; 4) el retorno de las muestras a la temperatura ambiente
(después de la criopreservación) sumergiendo los crioviales en un baño
de agua, a la temperatura de 40 oC, por 80 s. y 5) la
disminución gradual de la concentración de solutos, una vez que la
muestra ha sido retirada del nitrógeno líquido, mediante una solución
1,2 M de sacarosa (solución de recuperación; Panis et al., 2020Panis,
B.; Nagel, M. y Van den houwe, I. (2020). Challenges and prospects for
the conservation of crop genetic resources in field genebanks, in in
vitro collections and/or in liquid nitrogen. Plants 2020, 9, 1634; https://doi.org/10.3390/plants9121634
).
El
método de la vitrificación tiene como ventajas sobre la encapsulación
deshidratación mayor tasa de regeneración después de la recuperación y
un período de tiempo más corto para la ejecución del protocolo (Matsumoto, 2017Matsumoto,
T. (2017). Cryopreservation of plant genetic resources: Conventional
and new methods. Reviews in Agricultural Science, 5: 13–20. https://doi.org/10.7831/ras5.13
). Este protocolo fue propuesto por Keller y Senula (2013) para la criopreservación de ajo, utilizando la solución de vitrificación PVS3Keller, E.R.J. y Senula, A. (2013). Micropropagation and cryopreservation of garlic (Allium sativum L.). En: M. Lambardi et al. (eds.), Protocols for Micropropagation of Selected Economically-Important Horticultural Plants, Methods in Molecular Biology, vol. 994. https://doi.org/10.1007/978-1-62703-074-8_28.
.
En Cuba, se han obtenido buenos resultados aplicando el protocolo
vitrificación con la solución PVS3 para la criopreservación de ápices de
la piña (Villalobos et al., 2016Villalobos
Olivera. A.; Méndez Pelegrín, R.; Nápoles Borrero, L.; González Olmedo,
J.; Iglesias Alfonso, A.; Martínez Rodríguez, J.; Rodríguez Escriba,
R.C.; Lorente González, G.Y.; Quintana Bernabé, N.; Rodríguez Sánchez,
R.; Vidigal Duarte Souza, F. y Martínez Montero, M.E. (2016). Estrategia
criogénica para el establecimiento de un banco de germoplasma de piña
(Ananas comosus var. Comosus). Cultivos Tropicales, vol. 37, no.
especial, pp. 81-90. https://doi.org/10.13140/RG.2.1.2962.9045
) y el ajo (Torres, 2022Torres, M.A. (2022). Viabilidad y recuperación de plantas de ápices crioconservados de ajo (Allium sativum L.). Agrotecnia de Cuba. Vol 46 (1):1-11. ISSN 2414-4673.
).
Encapsulación-vitrificación
⌅Fue desarrollado por Matsumoto et al., en 1995Matsumoto, T; Sakai, A; Takahashi, C y Yamada, K. (1995). Cryopreservation of in vitro-grown meristems of wasabi (Wasabia japonica) by encapsulation-vitrification method. CryoLetters. 16: 189-196
.
Es una combinación del protocolo encapsulación-deshidratación y la
vitrificación. El mayor mérito de esta técnica combinada es la mejor
protección de las muestras encapsuladas durante la vitrificación y la
reducción del tiempo necesario para la deshidratación, comparado con el
método clásico de encapsulación deshidratación (Jiroutová y Sedlák, 2020Jiroutová, P. y Sedlák, J. (2020). Cryobiotechnology of Plants: A Hot Topic Not Only for Gene Banks. Appl. Sci. 2020, 10, 4677; https://doi.org/10.3390/app10134677
).
Protocolo gota (droplet)-vitrificación
⌅Este
método combina las soluciones altamente concentradas (PVS2 y PVS3) de
la vitrificación con el enfriamiento ultra-rápido del protocolo “droplet
freezing”. Se utilizó por primera vez por Pennycooke y Towill, en el 2000Pennycooke, J.C. y Towill, L.E. (2000). Cryopreservation of shoot tips from in vitro plants of sweet potato (Ipomoea batatas (L.) Lam) by vitrification. Plant Cell Rep. 19, 7: 733-737. https://doi.org/10.1007/s002999900171
, para la criopreservación de ápices de plantas in vitro de boniato (Ipomea batatas L. Lam). Los ápices de 0,5 a 1 mm, se precultivaron en sacarosa por 24
horas, y se trataron según el protocolo de la vitrificación (respecto a
la exposición a la solución de carga y la deshidratación con la solución
de vitrificación PVS2). A continuación, se colocaron en 10 μL de esa
solución de vitrificación sobre láminas de aluminio estéril (40 x 2 mm),
las que se sumergieron en nitrógeno líquido parcialmente solidificado
(velocidad de enfriamiento de 400 oC.s-1).
El
protocolo gota vitrificación, utilizando la solución PVS2, se ha
empleado con éxito para la creación de colecciones criopreservadas de
diferentes cultivos. Se optimizó en el Centro Internacional de la Papa
(CIP), radicado en Perú (Vollmer et al., 2017Vollmer,
R.; Villagaray, R.; Cárdenas J.; Castro M.; Chávez O. Anglin N.L y
Ellis, D. (2017). A large-scale viability assessment of the potato
cryobank at the International Potato Center (CIP). In Vitro
Cell.Dev.Biol.—Plant (2017) 53:309–317. https://doi.org/10.1007/s11627-017-9846-1
),
y se ha aplicado para un amplio rango de especies y genotipos de papa
(~ 3250), con una alta tasa media de recuperación de plantas completas
(~ 60 %) (Vollmer et al., 2021Vollmer,
R.; Espirilla, J.; Villagaray, R.; Cárdenas, J.; Castro, M.; Sánchez,
J.M.; Manrique-Carpintero, N.; Ellis, D. y Anglin, N.L. (2021).
Cryopreservation of potato shoot tips for long-term storage. En: Solanum tuberosum. Methods and protocols. D. Dobnik, K. Gruden, Ž. Ramšak y A. Coll (eds.) Humana Press. 21-54. https://doi.org/10.1007/978-1-10716-1609-3.
). También se empleó para la implementación de colecciones criopreservadas de ápices de Musa spp. en el Centro Internacional de Tránsito de Germoplasma de Musa, en Bélgica (Panis et al., 2011Panis,
B.; Piette, B.; André, E.; Van den houwe, I. y Swennen, R.( 2011).
Droplet vitrification: the first generic cryopreservation protocol for
organized plant tissues? En: Proc. First IS on Cryopreservation in Hort.
Species. Eds.: B. Panis and P. Lynch Acta Hort. 908, ISHS.
)
y de ápices de yemas de cítricos en el Laboratorio Nacional para
Preservación de Recursos Genéticos (NLGRP, por sus siglas en inglés) de
Fort Collins, E.U. (Volk et al., 2019 Volk, G.M.; Jenderek, M.M.; Walters C.; Bonnart, R.; Shepherd,
A.; Skogerboe, D.; Hall, B.D.; Moreland, B.; Krueger, R. y Polek, M.R.
(2019). Implementation of Citrus shoot tip cryopreservation in the
USDA-ARS National Plant Germplasm System. Acta Hortic. 1234. ISHS 2019. https://doi.org/10.17660/ActaHortic.1234.43. Proc. III International Symposium on Plant Cryopreservation Eds.: K. Thammasiri et al.
).
Wilms et al. (2020)Wilms,
H.; Sleziak, N.F.; Van der Auweraer, M.; Brands, M.; Verleije, M.;
Hardeman, D. Andre, E. y Panis, B. (2020). Development of a fast and
user‑friendly cryopreservation protocol for sweet potato genetic
resources. Scientific Reports. 10: 14674. https://doi.org/10.1038/s41598-020-70869-3
también publicaron la optimización del protocolo gota vitrificación,
con la solución PVS2, para la criopreservación de diez cultivares de
boniato, originarios de cuatro continentes, procedentes del Banco de
Germoplasma del CIP. Los autores determinaron que el 70 % de los
cultivares evaluados mostraron valores de regeneración superiores al 45
%.
El protocolo gota vitrificación, utilizando la solución PVS3,
también se ha aplicado en gran escala, como es el caso de la
implementación de una colección criopreservada de Allium en el Banco de Germoplasma de la Administración de Desarrollo Rural de la República de Korea (Kim et al., 2012Kim, H.H., Popova, E., Shin, D.J.; Yi, J.Y.; Kim, C.H., Lee, J.S., Yoon, M.K. y Engelmann, F. (2012). Cryobanking of Korean Allium germplasm collections: Results from a 10 year experience. CryoLetters 33 (1): 45-57. PMID 22434122
).
La
principal ventaja del protocolo gota-vitrificación es la posibilidad de
obtener muy altas velocidades de enfriamiento y calentamiento (warming)
debido al pequeño volumen del medio crioprotector en el que se colocan
los explantes (Matsumoto, 2017Matsumoto,
T. (2017). Cryopreservation of plant genetic resources: Conventional
and new methods. Reviews in Agricultural Science, 5: 13–20. https://doi.org/10.7831/ras5.13
) y el uso de la lámina de aluminio, buen conductor de la temperatura.
Estos resultados son congruentes con la afirmación de Roque-Borda et al. (2021)Roque-Borda,
C.A.; Kulus, D.; Vacaro de Souza, A.; Kaviani, B. y Vicente, E.F.
(2021). Cryopreservation of agronomic plant germplasm using
vitrification-based methods: an overview of selected case studies. Int.
J. Mol. Sci. 2021, 22, 6157. https://doi.org/10.3390/ijms22116157
quienes señalaron que el método gota (droplet)-vitrificación es el más
aplicado a la criopreservación de las plantas de interés agronómico. Se
estima que, en el presente, se aplica a 111 especies de plantas, entre
las que se encuentran especies agrícolas de gran importancia (Panis et al., 2020Panis,
B.; Nagel, M. y Van den houwe, I. (2020). Challenges and prospects for
the conservation of crop genetic resources in field genebanks, in in
vitro collections and/or in liquid nitrogen. Plants 2020, 9, 1634; https://doi.org/10.3390/plants9121634
).
Protocolos V y D crio-placas
⌅Estos
métodos siguen el mismo principio que el método de la
gota-vitrificación: los pequeños volúmenes (goticas) se enfrían más
rápidamente a la temperatura del nitrógeno líquido comparado con los
volúmenes grandes. La principal diferencia es que en los métodos de las
crio-placas los meristemos se retienen en pequeñas gotas de alginato de
calcio, colocadas en una placa de aluminio, antes de ser deshidratados y
subsiguientemente, inmersos en el nitrógeno líquido (Panis et al., 2020Panis,
B.; Nagel, M. y Van den houwe, I. (2020). Challenges and prospects for
the conservation of crop genetic resources in field genebanks, in in
vitro collections and/or in liquid nitrogen. Plants 2020, 9, 1634; https://doi.org/10.3390/plants9121634
)
En
cuanto a la encapsulación de los explantes en alginato de calcio, las
crio-placas son similares al protocolo encapsulación-deshidratación. En
el caso de las crioplacas, se colocan gotas de alginato de sodio al 2-3 %
en las concavidades de las crioplacas, y en ellas se colocan los
explantes, que generalmente reciben un precultivo antes de la
encapsulación. A continuación, se hace gotear, sobre los explantes, una
solución de cloruro de calcio 0.1 M en medio Murashige y Skoog (MS, 1962)Murashige T. y Skoog, F. (1962). A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum 15: 473-497. https://doi.org/10.1111/j.1399-3054-1962.tb08052.x
basal. Una vez que los explantes quedan adheridos a las criopacas,
éstas se colocan en la solución de carga para su osmoprotección.
Niino et al. (2019)Niino,
T.; Yamamoto, S.; Matsumoto, T.; Engelmann, F.; Valle Arizaga, M. y
Tanaka, D. (2019). Development of V and D cryo-plate methods as
effective protocols for cryobanking. Proc. III International Symposium
of Plant Cryopreservation. Acta Hortic. 1234. ISHS. https://doi.org/10.17660/ActaHortic.2019.1234.33
señalaron que la placa de aluminio (que actúa como soporte de los
explantes) es resistente y reutilizable, con una alta conductividad
térmica; la cual permite alcanzar velocidades de enfriamiento en el
entorno de los 4000 a 5000oC min-1 y velocidades de recalentamiento (el retorno a la temperatura ambiente) de 3000 a 4500oC min-1,
aspecto fundamental para evitar la cristalización del agua que pueda
quedar en las células. Las crioplacas de aluminio tienen dimensiones de
37 mm de largo, 7 de ancho y 0.5 de grosor; contienen 10 pequeñas
concavidades cuyo tamaño (que debe ser seleccionado de acuerdo a las
dimensiones del explante) varía de 1 a 3 mm de diámetro y 0,75 mm de
profundidad.
A partir de este paso, las técnicas se diferenciarán
es V crio-placa (vitrificación crio-placa) o D crio-placa
(deshidratación crio-placa), según el procedimiento a seguir. En el caso
de la V crio-placa, las muestras se exponen a una solución de
vitrificación para la deshidratación de los explantes, y a continuación
se siguen los mismos pasos del protocolo vitrificación. En el método D
crio-placa los explantes se deshidratan, ya sea colocándolos dentro de
un recipiente con sílica gel, o expuestos a la corriente de aire de una
cabina de flujo laminar, y a continuación se sigue el procedimiento de
la técnica encapsulación-deshidratación (Niino et al., 2019Niino,
T.; Yamamoto, S.; Matsumoto, T.; Engelmann, F.; Valle Arizaga, M. y
Tanaka, D. (2019). Development of V and D cryo-plate methods as
effective protocols for cryobanking. Proc. III International Symposium
of Plant Cryopreservation. Acta Hortic. 1234. ISHS. https://doi.org/10.17660/ActaHortic.2019.1234.33
).
Según Matsumoto (2017)Matsumoto,
T. (2017). Cryopreservation of plant genetic resources: Conventional
and new methods. Reviews in Agricultural Science, 5: 13–20. https://doi.org/10.7831/ras5.13
la clave de la criopreservación exitosa con el protocolo D crio-placa
radica en inducir la osmoprotección de los ápices mediante el precultivo
en sacarosa, el tratamiento con la solución de carga (LS), y en
determinar el tiempo óptimo para la deshidratación. Niino et al. (2013)Niino,
T.; Yamamoto, S.; Fukui, K.; Martínez, C.R.C.; Arizaga, M.V.;
Matsumoto, T. y Engelmann F. (2013). Dehydration improves
cryopreservation of mat rush (Juncus decipiens Nakai) basal stem buds on cryo-plate, CryoLetters. 34: 549-560.
,
por su parte, reportaron que las ventajas de esa técnica radica en que
puede ser aplicada a especímenes grandes y que es menos laboriosa que
otros métodos de criopreservación. Este protocolo supera la dificultad
asociada a la sensibilidad a la PVS2, una deshidratación insuficiente o
excesiva, así como el daño o la pérdida de material durante la escisión y
la manipulación (Matsumoto, 2017Matsumoto,
T. (2017). Cryopreservation of plant genetic resources: Conventional
and new methods. Reviews in Agricultural Science, 5: 13–20. https://doi.org/10.7831/ras5.13
).
En cuanto a la duración del tratamiento, Niino et al. (2013)Niino,
T.; Yamamoto, S.; Fukui, K.; Martínez, C.R.C.; Arizaga, M.V.;
Matsumoto, T. y Engelmann F. (2013). Dehydration improves
cryopreservation of mat rush (Juncus decipiens Nakai) basal stem buds on cryo-plate, CryoLetters. 34: 549-560.
señalaron que con la V crio-placa la duración óptima de la exposición a
la solución PVS es de 30-40 min, mientras que la duración de la
deshidratación con el método D crio-placa es de 2-4 h. El mayor tiempo
requerido por este método también ha sido señalado por otros autores (Yamamoto et al., 2015Yamamoto,
S.; Wunna; Rafique, T.; Valle Arizaga, M.; Fukui K.; Cruz Gutierrez,
E.J., Castillo Martinez, C.R.; Watanabe, K. y Niino T. (2015). The
aluminum cryo-plate increases efficiency of cryopreservation protocols
for potato shoot tips. Am. J. Potato Res. https://doi.org/10.1007/s12230-014-9425-5
; Wang et al.; 2020Wang,
M-R; Lambardi, M. Engelmann, F.; Pathirana, R.; Panis, B.; Volk, G.M. y
Wang, Q-C. (2020). Advances in cryopreservation of in vitro-derived
propagules: technologies and explant sources. Plant Cell Tissue Org.
2020. https://doi.org/10.1007/s112.40-020-01770-0
)
Yamamoto et al. (2015)Yamamoto,
S.; Wunna; Rafique, T.; Valle Arizaga, M.; Fukui K.; Cruz Gutierrez,
E.J., Castillo Martinez, C.R.; Watanabe, K. y Niino T. (2015). The
aluminum cryo-plate increases efficiency of cryopreservation protocols
for potato shoot tips. Am. J. Potato Res. https://doi.org/10.1007/s12230-014-9425-5
utilizaron los protocolos V crio-placa y D crio-placa para la
criopreservación de ápices de papa y obtuvieron valores de regeneración
de 96,7 % y 93,3 %, respectivamente. Estas técnicas tienen dos ventajas
principales: son de fácil manipulación debido a que las muestras están
sostenidas en las placas de aluminio y tienen una alta tasa de
regeneración a causa de las altas velocidades de enfriamiento y
calentamiento (a la temperatura ambiente) conferidas por la transmisión
de la temperatura que aporta la placa de aluminio (Niino et al., 2013Niino,
T.; Yamamoto, S.; Fukui, K.; Martínez, C.R.C.; Arizaga, M.V.;
Matsumoto, T. y Engelmann F. (2013). Dehydration improves
cryopreservation of mat rush (Juncus decipiens Nakai) basal stem buds on cryo-plate, CryoLetters. 34: 549-560.
).
Otra alternativa similar a las crio-placas es el protocolo denominado “crio-mesh” propuesto por Funnekotter et al. (2017)Funnekotter, B.; Bunn, E. y Mancera, R.L. (2017). Cryo-mesh: a simple alternative cryopreservation protocol. CryoLetters 38, 2: 155-159. https://www.researchgate.net. 3169
para la criopreservación de Anigozanthos viridis,
una especie endémica de Australia. El procedimiento general es similar
al del protocolo V crio-placa. La mayor diferencia entre ambos
protocolos es que el crio-mesh usa como soporte una malla de acero
inoxidable (Wang, et al., 2020Wang,
M-R; Lambardi, M. Engelmann, F.; Pathirana, R.; Panis, B.; Volk, G.M. y
Wang, Q-C. (2020). Advances in cryopreservation of in vitro-derived
propagules: technologies and explant sources. Plant Cell Tissue Org.
2020. https://doi.org/10.1007/s112.40-020-01770-0
). Este nuevo protocolo se comparó con la gota/vitrificación para la criopreservación de ápices de A. viridis, sin que se encontraran diferencias significativas en la supervivencia o
la regeneración. No obstante, como los propios autores señalan, el
protocolo crio-mesh debe ser evaluado en otras especies vegetales.
Comparación entre el método gota-vitrificación y las V y D crio-placas
⌅Debido
a que el método gota-vitrificación y los protocolos V y D crio-placas
tienen principios comunes, ha sido de interés de los investigadores
comparar la eficiencia de estos métodos en cuanto a la tasa de
regeneración de plantas post-criopreservación. Diversos autores han
señalado que el método gota-vitrificación y los métodos V y D
crio-placas poseen similares velocidades de enfriamiento y de retorno a
la temperatura ambiente (recalentamiento; warming) (Yamamoto et al., 2011Yamamoto,
S.; Rafique, T.; Priyantha, W.S.; Fukui, K.; Matsumoto, T. y Niino, T.
(2011). Development of a cryopreservation procedure using aluminium
cryo-plates. CryoLetters 32 (3): 256-265.
; Niino et al., 2013Niino,
T.; Yamamoto, S.; Fukui, K.; Martínez, C.R.C.; Arizaga, M.V.;
Matsumoto, T. y Engelmann F. (2013). Dehydration improves
cryopreservation of mat rush (Juncus decipiens Nakai) basal stem buds on cryo-plate, CryoLetters. 34: 549-560.
, 2019Niino,
T.; Yamamoto, S.; Matsumoto, T.; Engelmann, F.; Valle Arizaga, M. y
Tanaka, D. (2019). Development of V and D cryo-plate methods as
effective protocols for cryobanking. Proc. III International Symposium
of Plant Cryopreservation. Acta Hortic. 1234. ISHS. https://doi.org/10.17660/ActaHortic.2019.1234.33
; Funnekotter et al., 2017Funnekotter, B.; Bunn, E. y Mancera, R.L. (2017). Cryo-mesh: a simple alternative cryopreservation protocol. CryoLetters 38, 2: 155-159. https://www.researchgate.net. 3169
; Wang et al., 2020Wang,
M-R; Lambardi, M. Engelmann, F.; Pathirana, R.; Panis, B.; Volk, G.M. y
Wang, Q-C. (2020). Advances in cryopreservation of in vitro-derived
propagules: technologies and explant sources. Plant Cell Tissue Org.
2020. https://doi.org/10.1007/s112.40-020-01770-0
).
Tanto la gota-vitrificación como las V y D crio-placas son aplicables a
un amplio rango de genotipos de una especie, así como de las especies
de un género y producen niveles de regeneración de ápices comparables (Masumoto, 2017Matsumoto,
T. (2017). Cryopreservation of plant genetic resources: Conventional
and new methods. Reviews in Agricultural Science, 5: 13–20. https://doi.org/10.7831/ras5.13
; Niino et al., 2019Niino,
T.; Yamamoto, S.; Matsumoto, T.; Engelmann, F.; Valle Arizaga, M. y
Tanaka, D. (2019). Development of V and D cryo-plate methods as
effective protocols for cryobanking. Proc. III International Symposium
of Plant Cryopreservation. Acta Hortic. 1234. ISHS. https://doi.org/10.17660/ActaHortic.2019.1234.33
; Normah et al., 2019Normah
M. N; Sulong, N. y Reed B. M. (2019). Cryopreservation of shoot tips of
recalcitrant and tropical species: advances and strategies. Cryobiology
87:1–14. https://doi.org/10.1016/j.cryobiol.2019.01.008
; Panis, 2019Panis,
B. (2019). Sixty years of plant cryopreservation: from freezing hardy
mulberry twigs to establishing reference crop collections for future
generations. Proc. III International Symposium of Plant
Cryopreservation. Acta Hortic. 1234. ISHS. https://doi.org/10.17660/ActaHortic.2019.1234.1
; Wang et al., 2020Wang,
M-R; Lambardi, M. Engelmann, F.; Pathirana, R.; Panis, B.; Volk, G.M. y
Wang, Q-C. (2020). Advances in cryopreservation of in vitro-derived
propagules: technologies and explant sources. Plant Cell Tissue Org.
2020. https://doi.org/10.1007/s112.40-020-01770-0
), de manera que según Panis et al. (2020)Panis,
B.; Nagel, M. y Van den houwe, I. (2020). Challenges and prospects for
the conservation of crop genetic resources in field genebanks, in in
vitro collections and/or in liquid nitrogen. Plants 2020, 9, 1634; https://doi.org/10.3390/plants9121634
la selección de un método u otro queda al criterio de los investigadores.
Aplicación de la criopreservación a gran escala
⌅En la actualidad, cerca de 19 bancos de germoplasma criopreservan plantas de cultivo (Acker et al., 2017Acker,
J.P.; Adkins, S.; Alves, A.; Horna, D. y Toll, J. (2017). Feasibility
study for a safety backup cryopreservation facility; Independent expert
report. Bioversity International: Italy Roma (Italia): 100 p. ISBN:
978-92-9255-073-8
; Panis et al., 2020Panis,
B.; Nagel, M. y Van den houwe, I. (2020). Challenges and prospects for
the conservation of crop genetic resources in field genebanks, in in
vitro collections and/or in liquid nitrogen. Plants 2020, 9, 1634; https://doi.org/10.3390/plants9121634
),
y en diez instituciones ubicadas en Bélgica, República Checa, Colombia,
Nigeria, Perú, Alemania, Corea del Sur, la India y los Estados Unidos
se conservan cantidades sustanciales de accesiones criopreservadas de
cultivos de importancia económica. Se estima que cerca de 10 000
accesiones de cultivos propagados vegetativamente, iniciados como
cultivos in vitro, se conservan de forma segura mediante la criopreservación (Panis, 2019Panis,
B. (2019). Sixty years of plant cryopreservation: from freezing hardy
mulberry twigs to establishing reference crop collections for future
generations. Proc. III International Symposium of Plant
Cryopreservation. Acta Hortic. 1234. ISHS. https://doi.org/10.17660/ActaHortic.2019.1234.1
). Al respecto, Agrawal et al. (2019)Agrawal,
A.; Singh, S.; Vaidya Malhotra, E.; Meena D.P.S. y Tyagi, R.K. (2019).
In Vitro Conservation and Cryopreservation of Clonally Propagated
Horticultural Species. En: Springer Nature Singapore Pte Ltd. 2019 P. E.
Rajasekharan, V. R. Rao (eds.), Conservation and Utilization of
Horticultural Genetic Resources, https://doi.org/10.1007/978-981-13-3669-0_18
señalaron que en la India, el Banco de Germoplasma del Centro Nacional
de Recursos Genéticos Vegetales (NBPGR, por sus siglas en inglés)
mantenía 150 accesiones criopreservadas (62 de Allium) en la fase
líquida del nitrógeno y 13,363 en la fase de vapor, incluyendo diversos
cultivos en forma de semillas, embriones, ejes embrionarios, polen,
yemas de esquejes y ADN. Dentro de esta colección 7,517 accesiones
corresponden a especies hortícolas de importancia.
Estabilidad genética
⌅Existen
pocos eventos y reportes en la literatura que refieran modificaciones
genéticas relacionadas con la criopreservación, y si éstas ocurren el
mecanismo exacto y la naturaleza de la inestabilidad genética no ha sido
esclarecida, considerando los múltiples estados involucrados en el
proceso (cultivo in vitro-criopreservación-regeneración) (Benelli, 2021Benelli, C. (2021). Plant cryopreservation: a look at the present and the future. Plants 2021, 10, 2744. https://doi.org/10.3390/plants10122744
).
A
partir de los resultados de 20 publicaciones en las que se utilizaron
los marcadores moleculares para la evaluación de la estabilidad genética
de material conservado in vitro y criopreservado, Agrawal et al. (2019)Agrawal,
A.; Singh, S.; Vaidya Malhotra, E.; Meena D.P.S. y Tyagi, R.K. (2019).
In Vitro Conservation and Cryopreservation of Clonally Propagated
Horticultural Species. En: Springer Nature Singapore Pte Ltd. 2019 P. E.
Rajasekharan, V. R. Rao (eds.), Conservation and Utilization of
Horticultural Genetic Resources, https://doi.org/10.1007/978-981-13-3669-0_18
concluyeron que esos estudios no mostraron mayores variaciones del
material conservado en relación con el original, reforzando las
afirmaciones realizadas por Engelmann, en 2011Engelmann,
F. (2011). Use of biotechnologies for the conservation of plant
biodiversity. In Vitro Cellular & Developmental Biology – Plant, 47,
5–16. https://doi.10.1007/s11627-010-9327-2.
y Matsumoto, en 2017Matsumoto,
T. (2017). Cryopreservation of plant genetic resources: Conventional
and new methods. Reviews in Agricultural Science, 5: 13–20. https://doi.org/10.7831/ras5.13
. Coherentemente, Panis et al. (2020)Panis,
B.; Nagel, M. y Van den houwe, I. (2020). Challenges and prospects for
the conservation of crop genetic resources in field genebanks, in in
vitro collections and/or in liquid nitrogen. Plants 2020, 9, 1634; https://doi.org/10.3390/plants9121634
señalaron que en los tejidos mantenidos en el almacenamiento a la temperatura ultra-baja del nitrógeno líquido (-196 oC)
la ocurrencia de variaciones somáticas es muy escasa. A este respecto,
la criopreservación es la mejor opción para la conservación segura, por
largo tiempo, de los cultivos regenerativos.
Otras aplicaciones de la criopreservación
⌅Crioterapia. Además de la aplicación de las temperaturas ultra-bajas para la conservación de germoplasma, éstas tienen un efecto en la erradicación de patógenos, por lo que también se ha utilizado para esos fines, lo que se denomina crioterapia.
La crioterapia se basa en que el
tratamiento con el nitrógeno líquido destruye las células diferenciadas,
mientras que las células meristemáticas sobreviven y tienen la
capacidad de renovarse, dividirse, diferenciarse y regenerar en una
nueva planta libre de virus. Jiroutová y Sedlák (2020)Jiroutová, P. y Sedlák, J. (2020). Cryobiotechnology of Plants: A Hot Topic Not Only for Gene Banks. Appl. Sci. 2020, 10, 4677; https://doi.org/10.3390/app10134677
señalaron la combinación de la termoterapia y la crioterapia como un
procedimiento efectivo para la limpieza de virus, argumentando que la
termoterapia inhibe el movimiento de los virus hacia las células
meristemáticas de los ápices y al mismo tiempo causa alteraciones
subcelulares (como el agrandamiento de las vacuolas), lo cual resulta en
que una menor cantidad de células diferenciadas (e infectadas)
sobrevivan después de la inmersión en el nitrógeno líquido. Este
procedimiento se ha aplicado exitosamente a especies vegetales como la
papa, el boniato, el plátano (Musa spp.), la mora (Rubus idaeus L.), la uva (Vitis vinifera L.) y la manzana (Malus spp.).
La criopreservación del germoplasma de ajo
⌅En el presente, más de 10,000 accesiones de plantas propagadas in vitro están criopreservadas en forma segura y más del 80 % de éstas
pertenecen a cinco cultivos principales: la papa, la yuca, el plátano,
la mora y el ajo (Allium sativum L.) (Jiroutová y Sedlák, 2020Jiroutová, P. y Sedlák, J. (2020). Cryobiotechnology of Plants: A Hot Topic Not Only for Gene Banks. Appl. Sci. 2020, 10, 4677; https://doi.org/10.3390/app10134677
).
Protocolo vitrificación
⌅El primer artículo sobre criopreservación de ajo fue publicado por Niwata (1995)Niwata, E. (1995). Cryopreservation of apical meristemes of garlic (Allium sativum L.) and high subsequent plant regeneration. Cryo Lett. 16: 102-107.
.
Los explantes de los discos basales de dientes post-dormantes se
trataron mediante el protocolo vitrificación con la solución PVS2.
Posteriormente, Makowska et al. (1999)Makowska, Z.; Keller, J. y Engelmann, F. (1999) Cryopreservation of apices isolated from garlic (Allium sativum L.) bulbils and cloves. Cryo-Letters, 20(3): 175-182. ISSN 0143-2044.
ensayaron la criopreservación de ápices de bulbillos y dientes de ajo
con las soluciones de vitrificación PVS2 y PVS3, y señalaron que el
tratamiento con la solución PVS3 permitió la regeneración de los ápices,
mientras que no se obtuvieron resultados positivos con la solución
PVS2. Estos resultados fueron confirmados y ampliados por Keller, en el 2002Keller, E.R.J. (2002). Cryopreservation of Allium sativum L. (Garlic). Biotechnology in Agriculture and Forestry. En: L.E. Towill
y Y.P.S. Bajaj (Eds.) Cryopreservation of Plant Germplasm II. Vol. 50.
Springer-Verlag Berlin Heidelberg. https://doi.org/10.1007/978-3-662-04674-6_3
.
En contraste, Ellis et al. (2006)Ellis,
D.; Stogerboe, D.; Hellier, B. y Volk G. (2006). Implementation of
garlic cryopreservation techniques in the national plant germplasm
system. Cryo-Letters 27(2): 99-109. PMID
16794741.
criopreservaron 12 genotipos de ajo con el protocolo
vitrificación y encontraron que de los 10 genotipos que regeneraron,
cinco mostraron mejor respuesta al tratamiento con la solución PVS2 y
cuatro respondieron mejor a la PVS3.
En abril del 2007, comenzó
el proyecto EURALLIVEG (EURropean ALLIum germplasm VEGetatively
maintained), con la participación de Alemania, República Checa y
Polonia, para la creación de un criobanco tripartita de ajo. En ese
estudio, para las accesiones que producen vara floral se tomaron como
explantes ápices de bulbillos y para las que no las producen, se tomaron
ápices de vitroplantas. El protocolo de criopreservación utilizado fue
la vitrificación con la solución PVS3 (Zanke et al., 2011Zanke,
C; Keller E.R.J.; Zámečník, J.; Kotlińska, T. y Ola, M. (2011).
Cryopreservation of garlic for the establishment of a European Core
collection Acta Horticulturae https://doi.org/10.17660/ActaHortic.2011.908.55
).
Por otra parte, según lo señalado por Keller et al. (2012)Keller,
E.R.J.; Stavělíková, H.; Zámečník, J.; Kotlińska, T.; Kik, C.; Esnault,
F.; Solberg S. y Miccolis, V. (2012). EURALLIVEG: Establishment of a
European core collection by cryopreservation and virus elimination in
garlic. En: T. Wako (ed), Proc. 6th IS on Edible Alliaceae. Acta Hort. 969, ISHS 20: 319-327. https://doi.org/10.17660/Acta Hortic.2012.969.41
,
el alcance de ese proyecto se extendió al desarrollo de una colección
núcleo europea formada a partir de las colecciones nacionales de
Alemania, República Checa, Polonia, Italia y Francia. La colección
crioconservada contó de 200 accesiones; y en esos ensayos se encontró
que los explantes del cultivo in vitro tuvieron porcentajes de
regeneración más bajos que los esperados y que la distribución de los
porcentajes de regeneración entre las muestras tuvieron valores medios
del 50 % para los genotipos que producen vara floral y del 32 % para los
que no las producen.
Al respecto, Olas-Sochacka y Kotliňska (2015)Olas-Sochacka, M. y Kotliňska, T. (2005) International Cryobank of the genus Allium. En: Rybczyňski,J. y Puchalski, J.T. Monograhps of Botanical Gardens.(2): 35-39.
publicaron que para esa fecha el criobanco europeo de Allium mantenía 220 accesiones y que el proyecto EURALLIVEG constituyó un
modelo para posteriores actividades de criopreservación en los bancos de
germoplasma europeos.
Para los genotipos que producen vara
floral, se desarrolló, en el 2010, el proyecto de colaboración AEGIS
entre Alemania, Polonia y Portugal (Keller et al., 2011Keller,
E.R.J.; Kotlinska, T. y Reis, A. (2011). Cryopreservation of young
inflorescence bases in bolting garlic for germplasm storage (AEGIS
Project). https://www.ecpgr.cgiar.org.
),
en el que se estudió la criopreservación, tomando como fuente de
explantes los primordios de bulbillos de las inflorescencias. Las
inflorescencias desinfectadas y separadas de la espata se cortaron en
fragmentos de 1 mm de diámetro y 2 mm de largo, incluyendo la base
(conteniendo los primordios de bulbillos) y se llevaron a medio de
cultivo. De los nuevos brotes se obtuvieron explantes secundarios, en
los que se probaron los métodos vitrificación y gota-vitrificación con
las soluciones PVS2, PVS3 y PVS4 (35 % glicerol + 20 % etilenglicol +
0.6 M sacarosa) (Sakai, 2000Sakai,
A. (2000). Development of cryopreservation techniques. In: Engelmann F.
y Takagi, H. (eds) Cryopreservation of tropical plant germplasm –
current research progress and applications. Proc JIRCAS/IPCRI Joint Int.
Workshop, 20-23 Oct 1998, Tsukuba, Japan, 1-7. https://cgspace.cgiar.org
).
En la mayoría de los casos los explantes de las inflorescencias
inmaduras mostraron mayor regeneración que la que se había obtenido con
los bulbillos o los ápices de vitroplantas. El método gota-vitrificación
fue más efectivo que la vitrificación, y a pesar de que los resultados
no fueron coincidentes entre las instituciones, la regeneración con la
solución PVS3 fue algo mayor que con la PVS2, mientras que la PVS4
resultó inefectiva.
En China, Liu et al. (2017)Liu,
X.X.; Wen, Y.B.; Cheng, Z.H. y Mou, S.W. (2017). Establishment of a
garlic cryopreservation protocol for shoot apices from adventitious buds
in vitro. Scientia Horticulturae. 226: 10-18. https://dx.doi.org/10.1016/j.scienta.2017.08.016
estudiaron la criopreservación del cultivar ‘Gailiangsuan’ y los
resultados se verificaron con otros siete cultivares chinos
representantes de tres patrones diferentes de maduración. Como tipo de
explante se seleccionaron ápices de yemas adventicias formadas in vitro a partir primordios de bulbillos de inflorescencias inmaduras. Como
protocolo de criopreservación se probó la vitrificación con las
soluciones PVS2 y PVS3, y se obtuvo mejores porcentajes de regeneración
con la solución PVS3. En esas condiciones, cuatro cultivares de
maduración temprana mostraron baja tasa de regeneración debido a la
formación de bulbillos; mientras que para los cultivares de ciclo de
cosecha medio y largo la regeneración post-criopreservación fue del
51,5-82,6 % y del 44,8-75,9 %, respectivamente.
Protocolo gota vitrificación
⌅Los
estudios realizados en el Centro Nacional de Agrobiodiversidad de la
República de Korea, cristalizaron en el establecimiento de una colección
criopreservada de germoplasma de Allium en el Banco de Germoplasma de esa Institución (Kim et al., 2012Kim, H.H., Popova, E., Shin, D.J.; Yi, J.Y.; Kim, C.H., Lee, J.S., Yoon, M.K. y Engelmann, F. (2012). Cryobanking of Korean Allium germplasm collections: Results from a 10 year experience. CryoLetters 33 (1): 45-57. PMID 22434122
).
Según los autores, para las variedades que producen vara floral, la
fuente de explantes más apropiada fueron los primordios de los bulbillos
formados en las inflorescencias inmaduras, debido a que presentaron
altos porcentajes de regeneración post-criopreservación y niveles más
bajos de contaminación, seguido de los ápices de los brotes apicales de
los bulbos sencillos y de los dientes. Para el procesamiento de las
muestras, desarrollaron un protocolo estándar optimizado, consistente en
un precultivo en medio con sacarosa 0.3 M, por 2-3 días a 10 °C;
seguido por la deshidratación con la solución PVS3, por 150 min. y el
enfriamiento rápido en gotas de la solución PVS3 sobre láminas de
aluminio. La transferencia de las muestras a la temperatura ambiente se
realizó de 1-2 días después de la criopreservación. Ese protocolo se
aplicó a 1651 muestras de Allium de orígenes diferentes, las que
se almacenaron en el criobanco del Centro Nacional de Agrobiodiversidad
de Korea. La colección está integrada por muestras de bulbillos de
inflorescencias inmaduras, bulbillos maduros, bulbos simples o dientes,
de acuerdo a las características morfológicas de las accesiones. La
regeneración post-criopreservación estuvo en el rango del 33,6 al 100 %,
con un valor medio del 65,9 %.
Protocolo V crio-placa
⌅Las
investigaciones realizadas por el Centro de Recursos Genéticos de
Japón, en colaboración con las Universidades de Tsukuba y Shimane,
dieron como resultado que el protocolo V crio-placa, con la solución
PVS2 resultó apropiado para la implementación de un criobanco para las
especies de Allium, con tasas de regeneración cercanas al 100 % (Tanaka et al., 2020Tanaka, D.; Sakuma, Y.; Yamamoto, S.; Niino, T. y Matsumoto, T. Application of cryobanking for Allium spp., especially garlic shoot tips by V cryo-plate method. Hort. Res. (Japan) 2020. 19 (2)：189–195. https://doi.org/10.2503/hrj.19.189
). Los autores afirmaron que la efectividad de ese protocolo para la creación de un criobanco de Allium radica en que la inmersión directa en el nitrógeno líquido de los
ápices adheridos a las crioplacas permitió alcanzar velocidades de
enfriamiento y de recuperación de la temperatura ambiente más rápidas
que los protocolos vitrificación y gota vitrificación, lo que resultó en
mayores tasas de regeneración.
Los resultados expuestos mediante
diferentes protocolos tanto para la criopreservación de germoplasma de
ajo, como en general, muestran que es posible obtener la regeneración a
la criopreservación utilizando diferentes protocolos; por tanto, la
selección del protocolo, según Tanaka et al. (2018)Tanaka,
D.; Niino, T. y Uemura, M. (2018). Cryopreservation of plant genetic
resources. En: M. Iwaya-Inoue et al. (eds.). Survival strategies in
extreme cold and desiccation. Advances in Experimental Medicine and Biology 1081, https://doi.org/10.1007/978-981-13-1244-1_19
,
puede depender de la situación del laboratorio, los costos, la
sensibilidad de los explantes a las soluciones de vitrificación (PVS)
y/o la destreza del personal.
Colecciones criopreservadas de ajo
⌅En
la actualidad, se cuenta con tres criobancos mundiales para la
conservación de germoplasma de ajo: el Criobanco Europeo Tripartita que
mantiene 220 accesiones, de ellas 202 pertenecientes a la Colección
Núcleo Europea (Olas-Sochacka y Kotliňska, 2015Olas-Sochacka, M. y Kotliňska, T. (2005) International Cryobank of the genus Allium. En: Rybczyňski,J. y Puchalski, J.T. Monograhps of Botanical Gardens.(2): 35-39.
);
el criobanco del Centro Nacional de Agrobiodiversidad de la República
de Korea, con 1158 accesiones de ajo y otras especies de Allium, utilizando el protocolo gota-vitrificación (Kim et al. 2012Kim, H.H., Popova, E., Shin, D.J.; Yi, J.Y.; Kim, C.H., Lee, J.S., Yoon, M.K. y Engelmann, F. (2012). Cryobanking of Korean Allium germplasm collections: Results from a 10 year experience. CryoLetters 33 (1): 45-57. PMID 22434122
)
y una colección de 100 accesiones criopreservadas mediante la
vitrificación que se mantiene en Sistema Nacional de Germoplasma Vegetal
(NPGS, por sus siglas en inglés) en Colorado, EU. (Jenderek y Reed, 2017Jenderek,
M. M. y Reed, B. M. (2017). Cryopreserved storage of clonal germplasm
in the USDA National Plant Germplasm System. In Vitro Cell. Dev. Biol.
Plant. https://doi.org/10.1007/s11627-017-9828-3
).