Introducción
⌅El género Azotobacter se destaca por su potencial para estimular el crecimiento de las
plantas, por lo que a nivel mundial se han desarrollado diferentes
biofertilizantes comerciales a partir de cepas de este microorganismo,
que han sido utilizados para aumentar el rendimiento de hortalizas,
granos, pastos y frutales (Martínez y Dibut, 2012Martínez,
R. y Dibut, B. (2012). Biofertilizantes bacterianos. Editorial
Científico-Técnica. Instituto Cubano del Libro. ISBN 978-959-05-0659-8.
279 pp.
; Aasfar et al., 2021Aasfar, A., Bargaz, A., Yaakoubi, K., Hilali, A., Bennis, I., Zeroual, Y. y Meftah Kadmiri, I. (2021). Nitrogen fixing Azotobacter species as potential soil biological enhancers for crop nutrition and yield stability. Front. Microbiol, 12:628379. http://doi.org/10.3389/fmicb.2021.628379.
).
La
conservación de las cepas, que constituyen los principios activos de
estos bioproductos, es fundamental para garantizar su efectividad.
Internacionalmente, se utilizan diferentes métodos de conservación,
destacándose por su efectividad la liofilización, la criopreservación y
la ultracongelación (Quintero-Rodríguez et al., 2023Quintero-Rodríguez,
M. P., Montoya-Arango, D., Restrepo-Posada, D. C. y González-Gil, D. M.
(2023). Conservación de bacterias por liofilización en la Colección de
Microorganismos CM-EM-UDEA, Medellín, Colombia. Biota Colombiana24(2),
e1127. https://doi.org/10.21068/2539200X.1127.
).
Sin embargo, no todos los centros cuentan con el equipamiento necesario
para conservar a largo plazo sus cepas por estos métodos. Cuba no está
exenta de esta situación, la cual se agrava dado que no existe un centro
que se encargue de mantener la viabilidad y estabilidad genética y
metabólica de los microorganismos que se utilizan para el desarrollo de
los biofertilizantes en la agricultura.
En la literatura se
describen métodos alternativos para conservar los microorganismos.
Destacan dentro de ellos la suspensión en agua destilada estéril, en
capa de aceite mineral, la desecación en papel de filtro, suelo, arena,
sílicagel, entre otros (Pérez-Rodríguez et al., 2021Pérez-Rodríguez,
M., Díaz-Pérez, Y., Oliva-Llanes, N., Díaz-García, D.,
Gómez-Santiesteban, E., San Juan-Rodríguez, A. N., León-Fernández, V. y
Dopico-Ramírez, D. (2021). Evaluación de la efectividad de diferentes
métodos de conservación para las cepas de Rhizobium sp 3 y Lactobacillus rhamnosus LB/103-1-5. Icidca sobre los derivados de la caña de azúcar, 55(1), 70-79.
).
A partir de estas referencias, el presente estudio se propuso como
objetivo evaluar el efecto de dos métodos de conservación a mediano
plazo en las características morfológicas y metabólicas de cepas de Azotobacter sp.
Materiales y Métodos
⌅Microorganismos: Se utilizaron tres cepas de Azotobacter de la Colección de Bacterias Beneficiosas del INIFAT, cuya procedencia se muestra en la Tabla 1.
| Cepa | Procedencia |
|---|---|
| INIFAT-12 | Suelo Ferralítico Rojo. Municipio Güira de Melena. Provincia Artemisa |
| INIFAT-20 | Suelo Ferralítico Rojo. Municipio Güira de Melena. Provincia Artemisa |
| INIFAT-21 | Suelo Ferralíticos Rojo. Boyeros. Provincia La Habana |
Proceso de conservación: las cepas se revitalizaron mediante siembras por agotamiento en placas Petri de 90 mm, con medio de cultivo Asbhy sin nitrógeno (Martínez et al., 2006Martínez,
V. R., López, M., Brossard, F. M., Tejeda, G. G., Pereira, A. H.,
Parra, Z. C., Rodríguez, S. J. y Alba, A. (2006). Procedimientos para el
estudio y fabricación de biofertilizantes bacterianos. Ed. INIA -
Maracay. Venezuela, Serie B, No. 11,88 pp.
). Las
placas se incubaron durante 48 h a 30 °C, y una vez crecidos los
microorganismos se procedió a su conservación en agua destilada y
glicerol. Para ambos casos, se tomó una muestra de la biomasa bacteriana
que se adicionó en viales con 1 mL de agua destilada o glicerol al 30
%, según el método a utilizar. Se homogenizó y selló con parafina.
Posteriormente, la muestra suspendida en agua destilada se colocó a 5
°C; mientras que la que se contenía glicerol se colocó a -20 °C de
temperatura.
Evaluación de la pureza y viabilidad: después
de un año se evaluó la pureza y la viabilidad de las cepas conservadas.
Para ello, se tomó muestra de los viales las que fueron inoculadas en el
medio de cultivo sólido Asbhy sin nitrógeno (Martínez et al., 2006Martínez,
V. R., López, M., Brossard, F. M., Tejeda, G. G., Pereira, A. H.,
Parra, Z. C., Rodríguez, S. J. y Alba, A. (2006). Procedimientos para el
estudio y fabricación de biofertilizantes bacterianos. Ed. INIA -
Maracay. Venezuela, Serie B, No. 11,88 pp.
). Se
incubó (48 h, a 30 °C), y seguidamente, se describió la morfología de
las colonias y los caracteres morfotintoriales de las cepas mediante una
tinción de Gram (Madigan et al., 2018Madigan,
M. T., Bender, K.S., Buckley, D. H., Sattley, W. M. y Sthal, D.A.
(2018). Brock biology of microorganisms. Fifteenth Edition. Global
Edition. 1058 p. ISBN: 07-0-13-426192-8.
) y de manera cualitativa, el crecimiento bacteriano (+ crecimiento abundante y +/- poco crecimiento).
Evaluación de potencial estimulador del crecimiento vegetal: después de un año de conservación se determinó en las cepas la
presencia de mecanismos directos e indirectos de promoción del
crecimiento vegetal. En el primer caso se incluyó el potencial para
fijar nitrógeno atmosférico (FBN), solubilizar fosfato de calcio y
producir compuestos indólicos del tipo ácido indol acético. Para la FBN,
una muestra del material conservado se inoculó en el medio de cultivo
sólido Asbhy carente de nitrógeno combinado (Martínez et al., 2006Martínez,
V. R., López, M., Brossard, F. M., Tejeda, G. G., Pereira, A. H.,
Parra, Z. C., Rodríguez, S. J. y Alba, A. (2006). Procedimientos para el
estudio y fabricación de biofertilizantes bacterianos. Ed. INIA -
Maracay. Venezuela, Serie B, No. 11,88 pp.
). El
crecimiento bacteriano después del periodo de incubación (48 h, a 30 °C)
se consideró una respuesta positiva. Para evaluar la solubilización de
fosfato de calcio, su utilizó el medio de cultivo NBRIP sólido (Nautiyal, 1999Nautiyal,
S. C. (1999). An efficient microbiological growth medium for screening
phosphate solubilizing microorganism. FEMS Microbiology Letters, 170,
265-275.
), tomando como respuesta positiva la
formación de un halo alrededor de la colonia bacteriana. Para la
producción de compuestos indólicos, las bacterias se inocularon en el
medio de cultivo Agar Triptona Soya (BioCen) y se incubaron para su
crecimiento (48 h, a 30 °C); posteriormente, se adicionó a las placas 5
mL del reactivo de Salkowski y se incubó por 30 min en condiciones de
oscuridad. La aparición de una zona rosada alrededor de la colonia
indicó la liberación de este tipo de compuestos por parte del
microorganismo.
Como mecanismos indirectos de estimulación se
evaluó la liberación de enzimas líticas y la actividad antagonista
frente a hongos fitopatógenos. Para valorar la liberación de enzimas
amilasas, proteasas y lipasas se utilizaron los métodos y medios de
cultivo descritos por Cruz Cárdenas et al. (2021)Cruz
Cárdenas, C. I., Zelaya-Molina, L. X., Chávez-Díaz. I. F., Rojas-Anaya,
E. y Arteaga-Garibay, R. I. (2021). Conservación de cepas microbianas
para biofertilizantes. Libro teórico Núm. 02. Centro Nacional de
Recursos Genéticos. Tepatitlán de Morelos. Jal. México. 90 pp.
,
y se calculó el radio de hidrólisis, mediante la relación entre el halo
formado alrededor de la colonia bacteriana y el tamaño de esta (Sánchez et al., 2020Sánchez,
E. M., Heredia, J. P., Buitrago, S. M. y Medina, J. P. (2020).
Aislamiento e identificación de microorganismos potencialmente
amilolíticos y celulolíticos de suelos de humedales de Bogotá. Revista
Colombiana de Biotecnología, XXII (1), 36-44.
). El efecto antagonista se determinó por el método de Cultivo Dual (Vera Loor et al., 2020Vera Loor, M., Bernal, A., Vera, D., Leiva, M., Rivero, A. y Agustín, A. (2020). Antagonismo in vitro de bacterias endófitas formadoras de endosporas frente a Moniliophthora roreri H.C Evans. Revista de Protección Vegetal, 35 (2), 8 pp. E-ISSN: 2224-4697.
). Se utilizaron los patógenos Fusarium chlamydosporum (cepa 2022) y Alternaria sp. (cepa 3403) procedentes de la Colección de Cultivos Puros de Hongos
del INIFAT. Las cepas bacterianas se inocularon de manera
independiente, a 4 cm del borde de la placa Petri con el medio de
cultivo Agar Papa Dextrosa (PDA) (BioCen), mientras que en borde
equidistante se colocó un disco de 5 mm del patógeno previamente crecido
en este mismo medio de cultivo. Tras siete días de incubación a 30 °C
se midió el diámetro del micelio fúngico tanto en las placas inoculadas
con las bacterias como en las placas Testigos, donde solamente se
inoculó el hongo. Con esos datos se calculó el porcentaje de inhibición
micelial (IM = ((di-dt)/dt)*100; donde di: diámetro del micelio fúngico
en las placas inoculadas y dt: diámetro del micelio fúngico en las
placas testigo) (Vera Loor et al., 2020Vera Loor, M., Bernal, A., Vera, D., Leiva, M., Rivero, A. y Agustín, A. (2020). Antagonismo in vitro de bacterias endófitas formadoras de endosporas frente a Moniliophthora roreri H.C Evans. Revista de Protección Vegetal, 35 (2), 8 pp. E-ISSN: 2224-4697.
).
Por último, se evaluó el efecto de la aplicación de las tres cepas de Azotobacter después de un año de conservación sobre plántulas de tomate (Solanum lycopersicum L.). El contenido de los viales se adicionó en erlenmeyers con 50 mL de
Caldo Triptona Soya (BioCen). Estos se colocaron en una zaranda
(Labolan) a 110 r.p.m de agitación, 30 °C de temperatura, durante 48 h.
El ensayo se realizó en condiciones semicontroladas (casa de cristal),
en cepellones de 45 alveolos con suelo Ferralítico Rojo Lixiviado
agrogénico (Hernández et al., 2020Hernández,
A., Morales, M., Carnero, G., Hernández, Y., Terán, Z., Grandio, D.,
Bojórnes, J. I., Vargas, D., Bernal, A., Terry, E., González, P. J.,
Cabrera, J. A. y García, J. D. (2020). Nuevos resultados sobre el cambio
de las propiedades de los suelos Ferralíticos Rojos Lixiviados de la
“Llanura Roja de la Habana”. Ediciones INCA, 159, ISBN
978-959-7258-04-9.
) donde se sembraron las semillas
de tomate cv V8, procedentes del Banco de Germoplasma Central de Cuba,
ubicado en el INIFAT. Los productos obtenidos a partir de la
multiplicación de las bacterias se aplicaron directamente al suelo, a
razón de 25 mL por cepellón. Se dio seguimiento diario al crecimiento de
las plántulas, las que se extrajeron a los 20 días para evaluar la
altura de las mismas y la longitud de la raíz (ambos medidos con una
regla graduada (cm), diámetro del tallo (mm) (medido con un pie de rey
digital, 0.05 mm de error), número de hojas (u) y masa fresca de la
plántula (g). Para esto último, las muestras se pesaron en una balanza
semianalítica marca Nahita (error 0,01 g).
Diseño experimental y procesamiento estadístico: todos los experimentos se realizaron bajo un Diseño Completamente
Aleatorizado. Contaron con dos réplicas y tres repeticiones, a excepción
del ensayo con planta donde se utilizaron 15 plántulas por tratamiento.
Para el procesamiento estadístico primero se comprobó la normalidad y
homogeneidad de las varianzas con las pruebas de Cochran C (1941)Cochran,
W. G. (1941) The distribution of the largest of a set of estimated
variances as a fraction of their total. Annals of Eugenics, 11: 47-52. https://doi.org/10.1111/j.1469-1809.1941.tb02271.x
, Bartlett (1937)Bartlett, M. S. (1937). Properties of sufficiency and statistical tests. Proceedings of the Royal Society of London. Series A, Mathematical and Physical Sciences, 160(901), 268-282. https://doi.org/10.1098/rspa.1937.0109
y Hartley (1950)Hartley, H. O. (1950) The maximum F-ratio as a short-cut test for heterogeneity of variance. Biometrika 37, no. 3/4 (1950): 308-312.
; y posteriormente, se realizaron Análisis de Varianza. Las medias se compararon mediante una Prueba de Duncan (Lerch, 1977Lerch, G. (1977) La experimentación en las ciencias biológicas y agrícolas. La Habana, Cuba: Editorial Científico-Técnica.
) (5 % de probabilidad de error). Se utilizó el programa STATGRAPHICS Plus versión 5.0 (STATGRAPHICS Plus versión 5.0, Online Manual, 2000STATGRAPHICS Plus versión 5.0 Online Manual, 2000. www.statgraphics.com.
).
Resultados y Discusión
⌅Evaluación de la pureza y viabilidad de los microorganismos
⌅Las tres cepas de Azotobacter se mantuvieron viables después de un año de conservación, tanto en agua destilada estéril a 5 °C, como en glicerol al 30 % a -20 °C de temperatura. En la Tabla 2 se pueden observar las características culturales (morfología de las colonias) y morfotintoriales de los microorganismos al concluir el periodo de conservación, así como los resultados de la evaluación cualitativa de su crecimiento en el medio de cultivo Asbhy sin nitrógeno.
| Tratamientos | Caracteres culturales (medio de cultivo Asbhy sin nitrógeno) | Respuesta a la Tinción de Gram | Crecimiento (medio de cultivo Asbhy sin nitrógeno) |
|---|---|---|---|
| Agua destilada (5°C) | Forma circular, bordes enteros, superficie lisa, elevación convexa, traslúcida | Bacilos cortos Gram negativos | +/- |
| Glicerol al 30 % (-20°C) | Forma circular, bordes enteros, superficie lisa, elevación convexa, traslúcida | Bacilos cortos Gram negativos | + |
La morfología de las tres cepas coincide con la descrita para el género Azotobacter en otras investigaciones (Zavala et al., 2020Zavala, J., Alcarraz, M. y Julian, J. (2020). Evaluación para la producción de Azotobacter sp. promotor de crecimiento para cultivos de Coffea arabica. Ciencia e Investigación, 23 (1), 45-50. http://dx.doi.org/10.15381/ci.v23i1.18751.
).
La literatura destaca como una de las características de este grupo
bacteriano la formación de quistes que le permiten resistir condiciones
ambientales adversas (Pavone, 2022Pavone,
D. (2022). Azotobacter en la agricultura: una bacteria biofertilizante
que protege a las plantas. TecnoVita. Disponible en: http://tecnovitaca.com.
),
elemento que pudo influir en el mantenimiento de la viabilidad y los
caracteres morfológicos de estos microorganismos. En este sentido, se
deben resaltar los resultados de una investigación anterior, donde estas
tres cepas de Azotobacter toleraron condiciones de sequía, salinidad, variaciones de pH y temperatura (Ríos et al., 2024Ríos, Y., Ramos, B. y Ortega, M. (2024). Potencial estimulador del crecimiento de cepas de Azotobacter aisladas de agroecosistemas cubanos. Agrisost, 30, 1-8. ISSN-e 1025-0247 RNPS 1831. Disponible en: https://revistas.reduc.edu.cu/index.php/agrisost.
), aspecto que se asoció a la presencia de dichas estructuras.
Evaluación de potencial estimulador del crecimiento vegetal de los microorganismos
⌅Las cepas de Azotobacter conservadas durante un año tanto en agua destilada estéril a 5 °C como en glicerol al 30 % a -20 °C presentaron potencial para realizar el proceso de fijación biológica de nitrógeno al crecer en el medio de cultivo Asbhy carente de este nutriente. También mostraron resultados positivos para la producción de compuestos indólicos del tipo ácido indol acético, aunque ninguna solubilizó fosfato de calcio (Tabla 3).
| Cepa | Método de conservación | Fijación biológica de nitrógeno atmosférico | Solubilización de fósforo | Producción de compuestos indólicos |
|---|---|---|---|---|
| INIFAT-12 | Agua (5°C) | + | - | + |
| Glicerol 30% (-20°C) | + | - | + | |
| INIFAT-20 | Agua (5°C) | + | - | + |
| Glicerol 30% (-20°C) | + | - | + | |
| INIFAT-21 | Agua (5°C) | + | - | + |
| Glicerol 30% (-20°C) | + | - | + |
La
fijación biológica de nitrógeno y la producción de compuestos indólicos
como el ácido indol acético son mecanismos de estimulación del
crecimiento descritos para el género Azotobacter (Sumbul et al., 2020Sumbul,
A., Ali Ansari, R., Rizvi, R. y Mahmood, I. (2020). Azotobacter: a
potential bio-fertilizer for soil and plant health management. Saudi
Journal of Biological Sciences 27, 3634-3640. https://doi.org/10.1016/j.sjbs.2020.08.004.
)
a los cuales se han asociado de manera histórica los beneficios que
muestran los cultivos por la aplicación de la bacteria. En el caso de la
solubilización de fosfatos, aunque autores como Pavone (2022)Pavone,
D. (2022). Azotobacter en la agricultura: una bacteria biofertilizante
que protege a las plantas. TecnoVita. Disponible en: http://tecnovitaca.com.
y Zavala et al. (2020)Zavala, J., Alcarraz, M. y Julian, J. (2020). Evaluación para la producción de Azotobacter sp. promotor de crecimiento para cultivos de Coffea arabica. Ciencia e Investigación, 23 (1), 45-50. http://dx.doi.org/10.15381/ci.v23i1.18751.
alcanzaron resultados positivos, no es uno de los atributos más comunes
de este grupo bacteriano; y en particular, para las cepas en estudio ya
se habían obtenido resultados negativos en investigaciones precedentes (Ríos et al., 2024Ríos, Y., Ramos, B. y Ortega, M. (2024). Potencial estimulador del crecimiento de cepas de Azotobacter aisladas de agroecosistemas cubanos. Agrisost, 30, 1-8. ISSN-e 1025-0247 RNPS 1831. Disponible en: https://revistas.reduc.edu.cu/index.php/agrisost.
). Los mecanismos involucrados en el proceso de solubilización para Azotobacter se encuentran en discusión. Sin embargo, se destaca dentro de las
posibles propuestas, la producción de ácidos orgánicos. La eficiencia
del proceso depende de la cantidad y tipo de ácidos que libere la
bacteria (Aasfar et al., 2021Aasfar, A., Bargaz, A., Yaakoubi, K., Hilali, A., Bennis, I., Zeroual, Y. y Meftah Kadmiri, I. (2021). Nitrogen fixing Azotobacter species as potential soil biological enhancers for crop nutrition and yield stability. Front. Microbiol, 12:628379. http://doi.org/10.3389/fmicb.2021.628379.
), elementos que también pudieron limitar la respuesta de las tres cepas en estudio.
Las
bacterias promotoras del crecimiento vegetal establecen interacción con
las plantas a través de mecanismos directos e indirectos. Dentro de los
mecanismos directos se encuentran la fijación de nitrógeno, la
solubilización de nutrientes y la producción de fitohormonas, mientras
que los indirectos se asocian con el control de organismos patógenos (Moreno-Valencia et al., 2023Moreno-Valencia,
F. D., Aguirre, K., Muñoz-Rojas, J. y Morales-García, Y. E. (2023). La
urgencia de usar rizobacterias promotoras del crecimiento de plantas
para detener el cambio climático. Alianzas y tendencias BUAP, 8(30):
i-xi. http://doi.org/10.5281/zenodo.8062473.
). En este sentido, como parte del estudio se evaluó para las tres cepas de Azotobacter después de un año de mantenidas bajo las condiciones de conservación,
la producción de enzimas líticas y el efecto antagonista frente a
patógenos fúngicos.
La producción de enzimas líticas fue diferente para todas las cepas (Figura 1 a), aunque solo se destacó la influencia del método de conservación para la INIFAT-20. La acción frente a los patógenos mostró diferencias significativas entre las bacterias para ambos patógenos. Frente a Alternaria sp, para todas las cepas y condiciones de conservación el porcentaje de inhibición micelial fue mayor al 30 %, no así para F. chlamydosporum, donde solo superó este valor la cepa INIFAT-12 conservada en agua destilada estéril (Figura 1 b).
La
producción de enzimas líticas por parte de las bacterias promotoras del
crecimiento vegetal se ha relacionado con su acción antagonista, debido
al efecto de estos compuestos sobre las paredes celulares de los hongos
(Blanco y Castro, 2021Blanco,
E. L. y Castro, Y. (2021). Antagonismo de rizobacterias sobre hongos
fitopatógenos, y su actividad microbiana en el potencial
biofertilizante, bioestimulante y biocontrolador. Revista Colombiana de
Biotecnología, 23(1), 6-16. http://doi.org/10.15446/rev.colomb.biote.v23n1.84808.
). Se debe destacar, que en estudios previos se demostró que estas tres cepas de Azotobacter liberan enzimas proteasas (Ríos et al., 2024Ríos, Y., Ramos, B. y Ortega, M. (2024). Potencial estimulador del crecimiento de cepas de Azotobacter aisladas de agroecosistemas cubanos. Agrisost, 30, 1-8. ISSN-e 1025-0247 RNPS 1831. Disponible en: https://revistas.reduc.edu.cu/index.php/agrisost.
),
característica que según los resultados aquí alcanzados se afecta para
las cepas INIFAT-12 e INIFAT-21 con los métodos de conservación
utilizados. Ello pudo incidir en su acción frente a los patógenos.
El
método de conservación influyó en el efecto biocontrol solo para la
cepa INIFAT-12 en los dos patógenos, y la cepa INIFAT-20 frente a Alternaria sp. No se encontró una relación directa entre estos resultados y la
producción de enzimas líticas, lo que hace suponer que estas cepas
presentan otros mecanismos de actividad antagonista. Al respecto, Pavone (2022)Pavone,
D. (2022). Azotobacter en la agricultura: una bacteria biofertilizante
que protege a las plantas. TecnoVita. Disponible en: http://tecnovitaca.com.
asoció la producción de sideróforos, sustancias antimicrobianas, toxinas y hormonas del crecimiento vegetal por parte de Azotobacter con su efecto biocontrol, mientras que Bolaños-Dircio et al. (2022)Bolaños-Dircio,
A., Segura, D., Toribio-Jiménez, J., Toledo-Hernández, E.,
Ortuño-Pineda, C., Ortega-Acosta, S.A., Palemón-Alberto, F. y
Romero-Ramírez, Y. (2022). Cysts and alkylresorcinols of Azotobacter vinelandii inhibit the growth of phytopathogenic fungi. Chilean Journal of Agriculture Research, 82(4). http://doi.org/10.4067/S0718-58392022000400658.
demostraron que la formación de quistes se relaciona de manera directa con la inhibición del crecimiento de patógenos como Fusarium, Aspergillus y Colletotrichum. También se ha comprobado la acción biocontroladora de especies de Azotobacter frente a Alternaria, Rhizoctonia, Macrophomina, Curvularia y Helminthosporium (Pavone, 2022Pavone,
D. (2022). Azotobacter en la agricultura: una bacteria biofertilizante
que protege a las plantas. TecnoVita. Disponible en: http://tecnovitaca.com.
), por tanto, este es un potencial que aunque menos abordado para el género, podría ser de gran interés en la búsqueda de bioproductos con un efecto integral sobre los cultivos.
La aplicación de los productos obtenidos a partir de las cepas de Azotobacter conservadas durante un año por los dos métodos evaluados en el estudio estimuló el crecimiento de las plántulas de tomate, en particular la altura de las posturas y la longitud de las raíces (Tabla 4).
| Tratamiento | Altura de la planta (cm) | Longitud de la raíz (cm) | Diámetro de tallo (mm) | Número de hojas promedio (u) | Masa fresca (g) |
|---|---|---|---|---|---|
| INIFAT-12 A | 5,52 b | 0,84 ab | 1,0 cd | 0,6 ab | 0,06 ab |
| INIFAT-12 G | 6,08a | 1,03 a | 1,39 a | 0,7 a | 0,07 a |
| INIFAT-20 A | 5,72 ab | 0,88 ab | 1,24 ab | 0,3 bc | 0,03 c |
| INIFAT-20 G | 5,78 ab | 0,70 b | 1,23 ab | 0,1 c | 0,06 ab |
| INIFAT-21 A | 5,97 ab | 0,53 c | 0,97 cd | 0,1 c | 0,05 bc |
| INIFAT-21 G | 5,92 ab | 0,70 b | 1,12 bc | 0,1 c | 0,06 ab |
| Testigo | 4,65 c | 0,60 c | 0,78 d | 0,1 c | 0,04 c |
| Esx | 0,1917 | 0,0799 | 0,0805 | 0,1273 | 0,0062 |
Medias
con letras distintas difieren significativamente para Prueba de Rangos
Múltiples de Duncan a un 5 % de probabilidad de error. A: conservación en agua; G: conservación en glicerol
El efecto marcado de Azotobacter sobre la altura de las posturas de tomate fue descrito también por autores como Pilatuña et al. (2021)Pilatuña,
M. F., González-Parra, M. M., Mero, M. E. y Risco, D. (2021).
Evaluación agronómica de bacterias fijadoras de nitrógeno aisladas de
suelos andinos en plántulas de lechuga y tomate. Investigación Agraria,
23(1): 47-52. http://dx.doi.org/10.18004/investig.agrar.2021.junio.2301680.
,
quienes comprobaron que el 75 % de los aislados utilizados en su
investigación ejercía una acción positiva sobre este indicador. Ello
podría estar relacionado directamente con la producción de fitohormonas
por parte de la bacteria, aspecto muy bien documentado para este género (Sumbul et al., 2020Sumbul,
A., Ali Ansari, R., Rizvi, R. y Mahmood, I. (2020). Azotobacter: a
potential bio-fertilizer for soil and plant health management. Saudi
Journal of Biological Sciences 27, 3634-3640. https://doi.org/10.1016/j.sjbs.2020.08.004.
).
La mejor respuesta de las variables de crecimiento se observó con la aplicación de la cepa INIFAT-12 mantenida en ambos métodos de conservación, microorganismo que al parecer es más eficiente que los restantes en su interacción con este cultivo. Sin embargo, se debe destacar la efectividad de las cepas INIFAT-20 e INIFAT-21 conservadas en glicerol. En estas dos últimas, al parecer el método de conservación ejerce una mayor influencia en su acción estimuladora.
Existen
diferentes métodos para la conservación de microorganismos. Estos se
clasifican por su alcance en métodos a corto y a largo plazo. Dentro de
los primeros, se encuentra la refrigeración, el subcultivo y el
glicerol; mientras que los métodos a largo plazo incluyen el aceite
mineral o la parafina líquida, el agua destilada, el suelo estéril, la
sílica gel y otros más eficientes como la liofilización, la
criopreservación, la encapsulación y el uso de nanopartículas. La
selección de la variante a utilizar dependerá del microorganismo, el
objetivo de la conservación y en especial, de las capacidades
tecnológicas del laboratorio (Senaratne y Jayaweera, 2024Senaratne,
W. M. T. N. y Jayaweera, J. A. A. S. (2024). Comparison of microbial
preservation methods: a narrative review. GERMS, 14 (4): 375-386. https://doi.org/10.18683/germs.2024.1447.
).
Es por ello, que evaluar alternativas económicas y de fácil
implementación resulta muy importante, con el fin de mantener viables y
estables genéticamente los microorganismos de interés aun cuando no se
cuente con un equipamiento de avanzada para este fin.
El agua
destilada y el glicerol tienen como ventaja un bajo costo y fácil
implementación, pero en ambos casos se pueden presentar riesgos de
contaminación, pérdida de viabilidad de los microorganismos, y
alteraciones de sus características metabólicas (Senaratne y Jayaweera, 2024Senaratne,
W. M. T. N. y Jayaweera, J. A. A. S. (2024). Comparison of microbial
preservation methods: a narrative review. GERMS, 14 (4): 375-386. https://doi.org/10.18683/germs.2024.1447.
),
de ahí que valorar su efectividad en cepas de interés es un aspecto
importante para seleccionar la variante que permita alcanzar mejores
resultados. En este sentido, se apreció que aunque la conservación con
glicerol al 30 % implica la adquisición de un reactivo y la congelación
del material biológico, es un alternativa más adecuada que el agua
destilada para mantener por al menos un año cepas de Azotobacter sp.
Conclusiones
⌅El método de conservación influye en las características morfológicas y la acción estimuladora del crecimiento de cepas Azotobacter, siendo posible conservar estas -20 °C de temperatura utilizando glicerol al 30 % como agente crioprotector durante un año con buenos resultados en cuanto a su estabilidad como promotoras del crecimiento vegetal.